細胞培養の凍結保存のための基本的なヒント

細胞培養の凍結保存のための基本的なヒント

細胞は、通常の成長活動中に代謝を継続し、さまざまなプロテアーゼの関与を必要とします。温度が-70°Cを下回ると、プロテアーゼが機能しなくなります。したがって、非常に低い温度の環境では、細胞は代謝活動を停止し、長期の貯蔵を許可する休眠状態に入ることができます。

1.実験資料

基材：

基本培養媒体

血清（従来のFBS/NBS）

ウルトラピアワークベンチ

滅菌ジメチルスルホキシド（DMSO）

滅菌PBSリン酸緩衝液溶液

ピペッティングガン

電気ピペッティングガン

実験の準備

a）凍結ソリューションの準備：

一般細胞：55％基底培地 + 40％ウシ血清（FBS/NBS） + 5％DMSO

重要な細胞：90％ウシ血清（FBS/NBS） + 10％DMSO

調製した凍結保存ソリューションを15 mL遠心分離機に照射し、後で使用するために4°Cで保管します。

（b）凍結する細胞の調製：

細胞を凍結する前に、良好な成長状態を持つ細胞を選択し、対数成長段階で選択し、細胞の状態を維持するために凍結する12〜24時間前に新鮮な培地に置き換えます。

2.実験手順

1.凍結する細胞の密度を観察します。これは約80％〜90％です。ピペット銃を使用して古い培地を吸引し、滅菌PBSを加えて細胞を1〜2回洗浄し、培養環境の残りの培地を除去します。

2.適切な量のトリプシンまたは消化器汁を追加して、トリプシンが細胞に入るようにし、消化のためにインキュベーターに入れます。顕微鏡下の細胞の状態を観察します：細胞質が収縮し、細胞がもはやシートに接続されていません。この時点で、STOPソリューションを追加して、消化プロセスを停止します。

3.細胞をゆっくりと泡立てて細胞懸濁液を形成し、1000 rpmで3〜5分間細胞懸濁液を遠心化します。

上清を廃棄し、適切な量の凍結溶液を追加し、細胞を均一にカウントするために静かにピペットを追加します。凍結保存培地で細胞密度を調整して、最終密度5×106/ml〜1×107/mlにします。

4.ピペット銃を使用して、予想される容量に応じて極低温チューブを分離し、自動キャッピングマシンを使用してキャップアンドシールします。

5.標準的な凍結保存プログラムは、-1°Cから-2°C/minの冷却速度であり、凍結する細胞は次のステップに従って徐々に凍結できます。室温→4°C（20分）→ - 20°C（30分）→-80°C°C（一晩）→液体窒素の長期貯蔵。

また、-80°Cの冷凍庫に-80°Cで一晩保管してから、液体窒素に移して貯蔵することもできます。

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